маркер в медицине что это

Онкомаркеры

Статистика неумолима – заболеваемость раком во всем мире растет с каждым годом. Причин тому огромное множество – это и общее ухудшение экологической ситуации, распространение вредных привычек (курение, алкоголь), употребление канцерогенов в пищу или применение их в быту, старение населения и т.д. Отмечается также тенденция к уменьшению среднего возраста больных, рак «молодеет». К счастью, медицина не стоит на месте, онкология в настоящее время – одно из приоритетных направлений. Современные технологии позволяют диагностировать рак на самых ранних стадиях, а значит существенно увеличить вероятность излечения. Одним из наиболее эффективных способов диагностики онкологических заболеваний в настоящее время является анализ на онкомаркеры.

Что такое онкомаркеры

Онкомаркеры – это особые белки, которые обнаруживаются в крови или моче больных раком. Опухолевые клетки продуцируют и выделяют онкомаркеры в кровь с момента возникновения новообразования, что делает возможным диагностику заболевания на ранних стадиях.

Анализ на онкомаркеры – самый надежный способ обнаружения злокачественной опухоли и возможность оценить эффективность лечения. Рецидив злокачественных заболеваний можно предвидеть за несколько месяцев до начала клинических проявлений. Благодаря специфичности каждого белка можно предположить очаг заболевания.

Отклонение от нормы одних маркеров однозначно свидетельствует о поражении определенных органов (ПСА, сПСА), другие онкомаркеры могут обнаруживаться при различных локализациях опухоли. В этом случае целесообразно провести комплексное обследование. К сожалению, именно поэтому диагностика рака на основе одного только анализа на онкомаркеры не является достоверной.

Анализы на онкомаркеры

Каждое новообразование выделяет строго определенный белок. Известно около 200 соединений, относящихся к опухолевым маркерам, но диагностическую ценность из них имеет не более 20. Наиболее часто проводят анализы на следующие виды онкомаркеров.

Онкомаркер АФП (Альфа-фетопротеин)

АФП сходен по составу с альбумином. У взрослых людей норма АФП обычно находится в пределах 15 нг/мл.

Концентрация выше 10 МЕ(международная единица)/мл считается патологической.
Повышенный уровень АФП может говорить о наличии следующих злокачественных заболеваний:

Тератокарцинома желточного мешка, яичника или яичек (эмбриональный рак)
Уровень АФП может повышаться при некоторых доброкачественных заболеваниях – циррозе печени, хроническом и остром гепатите, хронической почечной недостаточности. При беременности повышение АФП может быть признаком пороков развития плода.

АФП выявляется в плазме крови, амниотической жидкости, желчи, плевральной и асцитической жидкостях.

Онкомаркер Б-2-МГ (Бета-2-микроглобулин)

Онкомаркер Бета-2-микроглобулин можно обнаружить во всех клетках, кроме эритроцитов и клеток трофобласта.

В норме Бета-2-микроглобулин выявляется в моче в очень малых количествах.

Повышение концентрации в крови может говорить о почечной недостаточности.

Показатель этого маркера связан с активностью иммунитета, и может возрастать при любом воспалительном заболевании.

Анализ на Бета-2-микроглобулин назначают при подозрении на:

Рекомендуется учитывать показатель Б-2-МГ при оценке приживаемости после трансплантации органов.

Онкомаркер ПСА (специфический антиген простаты), сПСА (свободный антиген простаты)

ПСА присутствует в здоровой, чрезмерно развитой и трансформированной ткани простаты. Это самый специфичный и чувствительный антиген, позволяющий диагностировать рак предстательной железы.

Для исследования берут кровь (сыворотку или плазму), до биопсии, удаления или массажа простаты, т.к. механическое раздражение железы может вызывать повышение уровня ПСА, сохраняющееся до 3-х недель.

Норма ПСА – 0-4 нг/мл, уровень 10 нг/мл и выше свидетельствует о злокачественном заболевании. При уровне ПСА 4-10 нг/мл желательно определить и сПСА.

Отношение концентрации сПСА к концентрации ПСА, выраженное в процентах имеет диагностическое значение:

Онкомаркер РЭА (раково-эмбриональный антиген)

Онкомаркер РЭА вырабатывается во время беременности клетками пищеварительного тракта плода. У взрослых людей синтез практически полностью подавляется.

Уровень РЭА в норме – содержание в крови не более 0-5 нг/мл.

Уровень РЭА повышается при злокачественных заболеваниях:

Некоторое повышение онкомаркера РЭА возможно при хронической почечной недостаточности, гепатитах и других хронических заболеваниях печени, панкреатите, у курильщиков, а также у больных туберкулезом и аутоиммунными заболеваниями.

Онкомаркер CA 125

СА 125 – стандартный онкомаркер рака яичников. В норме концентрация онкомаркера СА 125 в крови — 0-30 МЕ/мл.

Повышенный уровень CA 125, более 30 МЕ/мл может указывать на злокачественные заболевания:

Повышенная концентрации СА 125 обнаруживается у женщин, больных эндометриозом и аденомиозом (заболевания, при которых клетки, выстилающие внутреннюю поверхность матки, обнаруживаются в других частях организма). Физиологически наблюдается повышение при беременности и во время менструации.

Онкомаркер СА 15-3

Онкомаркер СА 15-3 – специфический онкомаркер рака молочной железы.
В норме уровень СА 15-3 составляет 0-22 ЕД/мл.

Концентрация свыше 30 МЕ/мл говорит о патологии. У 80% женщин, с метастазирующим раком молочной железы уровень маркера повышен.

Онкомаркер СА 15-3 эффективен в определении рецидивов. Некоторое повышение маркера также может наблюдаться во время беременности.

Онкомаркер СА 19-9

Патологической считается концентрация в крови 40 МЕ/мл и выше. СА 19-9 применяется при диагностике и контроле лечения:

Онкомаркер СА 242

Обнаруживается в тех же случаях, что и СА 19-9, но обладает более высокой специфичностью, позволяя определять рак поджелудочной железы, толстой и прямой кишки на самых ранних стадиях.

Это один из основных маркеров, используемых в диагностике. По результатам анализа этого онкомаркера можно спрогнозировать рецидив злокачественных заболеваний желудочно-кишечного тракта за несколько месяцев.

Значения нормы онкомаркера СА 242 — 0-30 МЕ/мл.

ХГЧ (хорионический гонадотропин человека)

Гормон, в норме повышающийся во время беременности, для защиты плода от иммунной системы матери.

Повышение ХГЧ у мужчин и небеременных женщин говорит о злокачественном росте.

Значение нормы ХГЧ: 0-5 МЕ/мл, значения выше 10 МЕ/мл наблюдаются при трофобластических опухолях, хорионкарциномы яичника или плаценты (наиболее чувствителен), раке яичек.

UBC (Urinary Bladder Cancer)

Маркер рака мочевого пузыря. Высокоспецифичный тест, эффективный на ранних стадиях. Определяют UBC в моче, находящейся в мочевом пузыре не менее 3 часов, за норму считается уровень 0,12*10-4 мкг/мкмоль, при злокачественном поражении мочевого пузыря концентрация повышается до 20,1-110,5*10-4 мкг/мкмоль.

Необходимо учитывать, что один онкомаркер может появляться при различных заболеваниях, поэтому для точной диагностики используют комбинацию маркеров. Например, при определении

Еще одной тонкостью является то, что повышенный уровень онкомаркеров не обязательно означает рак. Поэтому биохимические исследования обязательно должны подкрепляться клиническими.

Источник

Что показывает анализ крови на онкомаркеры

Чтобы узнать, что показывает анализ крови на онкомаркеры, необходимо правильно подготовиться и сдать его в первой половине дня. Сделать это можно в лаборатории как при клинике, так и в частном независимом медицинском учреждении с хорошей репутацией. Отметим, что цена анализа крови на онкомаркеры зависит от того, какой маркер нужно проверить, сколько всего таких тестов назначено и надежности выбранной лаборатории.

О чем говорят результаты анализа на онкомаркеры

Онкомаркеры – специфические белковые соединения, которые продуцируются патологическими образованиями в организме либо здоровыми клетками с целью защитить организм от зловредных процессов. В зависимости от этого есть маркеры, которые постоянно присутствуют в организме в минимальном количестве, и есть те, которые появляются только при наличии опухоли. Таким образом, необходимо знать, что показывает анализ крови на онкомаркеры группе риска и тем, кто однажды сталкивался с онкологией.

Данный анализ не назначается в случае отсутствия симптомов, генетической предрасположенности к раку. Лишь в исключительных случаях может быть показан лицам старше 50 лет, которые заняты на вредных производствах.

Результаты тестирования в данном случае могут показать наличие патологического уплотнения на ранней стадии (в зависимости от онкомаркера за 3-5 месяцев до проявления первых симптомов рака), воспалительного заболевания, доброкачественного новообразования, риск патологии у плода. Все это говорит о важности анализа на онкомаркеры в современной диагностике опухолей и патологий развития эмбриона.

Когда нужно сдавать кровь на маркеры и как подготовиться

Сразу отметим то, что показывает анализ крови на онкомаркеры, не является диагнозом. Это лишь первый шаг, который может нести до 95% отображения происходящего в организме. Поэтому проверке нормы онкобелка всегда сопутствуют другие способы обследования, в частности, магниторезонансная и компьютерная томография, ультразвуковое исследование, рентгенография.

Основными показаниями к анализу являются:

Проверка нормы онкомаркеров назначается группе риска и лицам после 50 лет, так как с возрастом продукция этих веществ увеличивается.

Отметим, что анализ крови на онкомаркеры у женщин и мужчин берется только на каждый вид отдельно, согласно назначению доктора. В зависимости от предположительной локации опухоли для ее выявления может быть достаточно проверить только один маркер. Но чаще всего полную картину дает группа, которая наилучшим образом сочетается между собой.

Подготовка в большинстве случаев не требует особых действий, и она практически аналогична требованиям к анализу на биохимию крови:

Также по возможности необходимо предупредить стрессовые ситуации и не нервничать. Помните, что соблюдение данных требований позволит получить качественный и достоверный результат.

Женщинам планировать анализ нужно исходя из периода менструального цикла. Выбрать подходящий день, когда гормональный фон оптимален, поможет соответствующий специалист.

Техника проведения проверки крови на онкобелки

Смысл тестирования сводится к тому, что нужно сдать анализ на онкомаркеры в специализированной лаборатории. Лучшее время для этой процедуры – промежуток между 8 и 12 часами утра.

Перед началом пациента усаживают на кушетку (в некоторых случаях нужно занять лежачее положение), затем берут кровь из вены традиционным способом при помощи шприца и переносят материал в пробирку с крышкой.

Полученная кровь проходит обработку в специальном оборудовании, где отделяется сыворотка от плазмы. Полученная сыворотка – это и есть образец, в который вводят антитела и наблюдают за взаимодействием. Полученная реакция – это результат анализа крови на онкомаркеры, и то, что он показывает, вносится в карточку пациента.

Нормы и расшифровка 10 самых информативных маркеров

Всего в медицине известно более 200 различных онкомаркеров. Но только около 20 признаны наиболее информативными.

Таким образом, имея показания либо предрасположенность к опухолям, необходимо срочно сдать анализ крови на онкомаркеры в инвитро по цене, которая в любом случае будет ниже, чем вероятное лечение.

Источник

Маркеры рака — что это такое?

Маркеры рака — что это такое?

Рак — одно из самых распространенных заболеваний в развитых странах. Однако современная медицина позволяет лечить рак на ранней стадии и эффективно, что возможно в случае ранней диагностики. Маркеры рака — это вещества, присутствие которых в организме может указывать на развитие заболеваний, в том числе рака. Читайте о маркерах рака, которые вы можете проверить.

Что такое онкомаркеры

Онкомаркеры — это вещества, наличие или концентрация которых выше нормы указывает на возможное течение онкогенеза и развитие опухолевых заболеваний.

Некоторые опухолевые маркеры вырабатываются только опухолевыми клетками — их обычно можно обнаружить на очень ранней стадии роста опухоли. Неопластические маркеры также могут быть веществами, которые естественным образом встречаются в организме и секретируются здоровыми тканями, такими как гормоны и ферменты, чрезмерно высокая концентрация которых указывает только на отклонения в организме.

Онкомаркеры — общая классификация

Маркеры рака — какие из них наиболее изучены?

Визуализация онкомаркеров по органам

» data-medium-file=»https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Визуализация-онкомаркеров-по-органам.jpg?fit=450%2C270&ssl=1″ data-large-file=»https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Визуализация-онкомаркеров-по-органам.jpg?fit=900%2C540&ssl=1″ loading=»lazy» src=»https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/%D0%92%D0%B8%D0%B7%D1%83%D0%B0%D0%BB%D0%B8%D0%B7%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F-%D0%BE%D0%BD%D0%BA%D0%BE%D0%BC%D0%B0%D1%80%D0%BA%D0%B5%D1%80%D0%BE%D0%B2-%D0%BF%D0%BE-%D0%BE%D1%80%D0%B3%D0%B0%D0%BD%D0%B0%D0%BC.jpg?resize=900%2C540&ssl=1″ alt=»Визуализация онкомаркеров по органам» width=»900″ height=»540″ srcset=»https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Визуализация-онкомаркеров-по-органам.jpg?w=900&ssl=1 900w, https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Визуализация-онкомаркеров-по-органам.jpg?resize=450%2C270&ssl=1 450w, https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Визуализация-онкомаркеров-по-органам.jpg?resize=768%2C461&ssl=1 768w» sizes=»(max-width: 900px) 100vw, 900px» data-recalc-dims=»1″ /> Визуализация онкомаркеров по органам

Маркеры рака — какие анализы проводятся?

Онкомаркеры — цель тестов:

Онкомаркеры — основные исследования:

Также возможно тестировать отдельные опухолевые маркеры, например CA 125, HE4, PSA, CEA, CA 15-3, CA 19-9.

Тестирование отдельных опухолевых маркеров

Тестирование отдельных опухолевых маркеров

» data-medium-file=»https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Тестирование-отдельных-опухолевых-маркеров.jpg?fit=450%2C279&ssl=1″ data-large-file=»https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Тестирование-отдельных-опухолевых-маркеров.jpg?fit=887%2C550&ssl=1″ loading=»lazy» src=»https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/%D0%A2%D0%B5%D1%81%D1%82%D0%B8%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D0%B5-%D0%BE%D1%82%D0%B4%D0%B5%D0%BB%D1%8C%D0%BD%D1%8B%D1%85-%D0%BE%D0%BF%D1%83%D1%85%D0%BE%D0%BB%D0%B5%D0%B2%D1%8B%D1%85-%D0%BC%D0%B0%D1%80%D0%BA%D0%B5%D1%80%D0%BE%D0%B2.jpg?resize=900%2C558&ssl=1″ alt=»Тестирование отдельных опухолевых маркеров» width=»900″ height=»558″ srcset=»https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Тестирование-отдельных-опухолевых-маркеров.jpg?w=900&ssl=1 900w, https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Тестирование-отдельных-опухолевых-маркеров.jpg?resize=450%2C279&ssl=1 450w, https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Тестирование-отдельных-опухолевых-маркеров.jpg?resize=887%2C550&ssl=1 887w, https://i0.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2020/08/Тестирование-отдельных-опухолевых-маркеров.jpg?resize=768%2C476&ssl=1 768w» sizes=»(max-width: 900px) 100vw, 900px» data-recalc-dims=»1″ /> Тестирование отдельных опухолевых маркеров

Онкомаркеры — точны ли эти тесты?

Повышенные уровни онкомаркеров связаны с воспалением и / или заболеванием в организме. К сожалению, некоторые из маркеров могут быть типичными для нескольких неопластических заболеваний или других нарушений здоровья. По этой причине перед постановкой окончательного диагноза необходима более глубокая диагностика.

Источник

Мáркеры для клеток: как ученые «раскрашивают» клетки, чтобы отличить одну от другой

Выделить все важное и отличить от других — вот задача клеточных мáркеров.

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: В этой статье рассказывается о том, как ученые научились в широком смысле «раскрашивать» клетки — выделять из общей смеси только те, которые им интересны, а остальные отсеивать. Речь пойдет как о естественных поверхностных и внутриклеточных мáркерах и способах их выявления, так и о более изощренных генетических способах маркировать клетки. Читателя ждет открытие, что штрих-коды бывают не только в магазинах, но и в клетках, а вирус иммунодефицита человека превратился в послушный инструмент.

Конкурс «био/мол/текст»-2017

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2017.

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий и партнером номинации «Биомедицина сегодня и завтра» выступила фирма «Инвитро».

Что первое приходит на ум неискушенному в науке человеку при слове «мáркер»? Бьюсь об заклад, что добрая половина представляет себе желтый широкий фломастер для выделения текста. Другая половина, наверняка, представляет себе черный нестираемый маркер, которым одно время были исписаны все трубы, заборы и веранды. Начертания «Маша + Саша = Любовь» скрепляли чувства подростков навечно, а менее романтичные, но выразительные фразы надолго свидетельствовали о личной неприязни. Встречались даже стихи. Однако предлагаю уважаемым читателям узнать еще одно значение этого слова — очень научное и так нужное всей современной биологии и биомедицине. В научном понимании и конкретно в клеточной биологии, слово «маркер» в широком смысле означает что-то, что отличает одну живую клетку (или группу клеток) от других. Это может быть молекула на поверхности клеточной мембраны, или какой-нибудь внутриклеточный белок, или вещество, которое синтезируется/накапливается только в этом конкретном виде клеток, или генетическая особенность, присущая только данному типу клеток. Условно все маркеры можно разделить на естественные, которые существуют сами по себе, и искусственные — введенные намеренно. Давайте разберемся с ними по порядку.

Естественные клеточные маркеры и способы их рассмотреть

В многоклеточных организмах существует клеточная специализация. Несмотря на то, что клетки содержат одинаковую ДНК, они отличаются друг от друга: клетки мышц умеют сокращаться, нейроны — проводить нервные импульсы, и так далее. Это происходит из-за того, что в каждом виде клеток работает только определенный набор генов из всего их разнообразия, содержащегося в ДНК. Именно поэтому маркером клеток может служить любой ген, который экспрессируется избирательно — только в каком-нибудь конкретном виде клеток. Особенно удобно, когда такой отличительный ген кодирует белок, располагающийся на поверхности клетки.

Раковые маркеры

Часто можно слышать слово — «онкомáркер». Это классический пример клеточных маркеров: молекул на поверхности опухолевых клеток, которые или не встречается совсем, или присутствуют в гораздо меньшем количестве на поверхности здоровых клеток. Одним из ярких примеров онкомаркеров является HER2-антиген на поверхности клеток рака груди (рис. 1) [1]. HER2 — рецептор эпидермального ростового фактора. В результате аномального увеличения количества копий гена этого рецептора в опухолевых клетках нарушается регуляция клеточного цикла, и опухоль начинает быстро расти. HER2+-варианты рака груди — очень агрессивны [2].

В этом случае у ученых есть целый набор методов, как можно «увидеть» клетки, несущие такой маркер, отличить их от остальных клеток и даже отсортировать: в одну пробирку — клетки с поверхностным маркером (или с несколькими маркерами), в другую — остальные. Эти методы основаны на использовании антител.

Антитела — специальные белки, которые могут распознавать молекулы за счет пространственного взаимодействия. Именно антитела играют важную роль в нашем иммунитете — они связываются с белками или другими молекулами на поверхности бактерий и вирусов, что и запускает иммунную реакцию. Современная наука научилась делать антитела против практически любых белков — в том числе и против поверхностных клеточных маркеров. Чтобы использовать антитела для определения маркеров, ученые прибегают к еще одной хитрости. Они присоединяют к антителу еще один белок: или фермент, или флуоресцирующий (светящийся) белок. Тогда, если к исследуемым клеткам добавить антитела против поверхностного маркера, связанные с ферментом, потом отмыть лишние антитела и добавить субстрат для фермента, который при расщеплении приобретает какой-нибудь цвет, то клетки, несущие на своей поверхности нужный маркер, окажутся окрашенными, а остальные клетки — останутся бесцветными (рис. 1).

Рисунок 1. Пример выявления онкомаркера HER2 с помощью антител (иммуногистохимия). Коричневые клетки несут на своей поверхности HER2.

Такая модификация выявления маркера называется иммуногистохимией («иммуно» — из-за того, что используют иммунные антитела, «химия» — потому что в методе присутствует химическая реакция расщепления субстрата ферментом, «гисто» — потому что чаще всего такой метод применяют к гистологическим срезам — тонким слайсам исследуемой ткани, которые закреплены на стеклянной подложке).

Другой метод, позволяющий выявлять поверхностные маркеры, называется проточной цитофлуориметрией (fluorescence-activated cell sorting, FACS) [3]. Здесь исследуемые клетки (в виде одноклеточной взвеси) смешивают с антителами, к которым присоединены флуоресцирующие белки. Антитела связываются со своими маркерами-мишенями, a не связавшиеся антитела удаляют. Далее клетки загружают в прибор. Он создает тонкую струю из клеточной суспензии, проходящую через свет лазера буквально по одной клетке. Если на поверхности клетки есть искомые маркеры, то вместе с клеткой в луч лазера попадают и антитела, связавшиеся с маркерами. Происходит возбуждение флуорофора на антителе, и он испускает на своей длине волны свет, который и регистрируется детектором (рис. 2).

Рисунок 2. Общий принцип проточной цитофлуориметрии.

После этого прибор может отклонить эту клетку из струи или в одну сторону, или в другую. Таким образом можно разделить клетки на две группы: с маркером и без. Получается, что прибор ­«знает», есть ли искомые маркеры на каждой из исследуемых клеток, сколько таких клеток, умеет сортировать нужные и ненужные клетки.

Описанные способы позволяют выявлять естественные маркеры — молекулы, которые и до начала исследования присутствовали на поверхности или внутри клеток. Эти методы сильно помогли ученым разобраться в том, чем опухолевые клетки отличаются от нормальных, стволовые клетки — от более зрелых и дифференцированных, и разные ткани — друг от друга.

Искусственные маркеры: внедрить и распознать

У описанных выше методов есть один существенный недостаток: они не позволяют установить родственные связи между клетками. Вот, предположим, у нас есть 100 клеток, и у 12 из них есть маркер А на поверхности. Все эти клетки А для нас будут на одно лицо, как близнецы (рис. 3).

Рисунок 3. Братья-близнецы из фильма «Приключения Электроника».

Мы не сможем сказать, произошли ли все эти 12 клеток от одной материнской и являются ли «близкими родственниками». Или, скажем, можно предположить, что они получились после деления нескольких клеток с исследуемым маркером и являются друг другу двоюродными, троюродными братьями и сестрами, а может быть и вовсе седьмой водой на киселе. Чтобы исследовать родственные связи в клеточной популяции (еще говорят — «исследовать клональный состав популяции» [4]) и следить за тем, как ведет себя потомство отдельных клеток, ученые научились вводить искусственные генетические маркеры в клетки. Делают это несколькими способами. Один из самых продвинутых способов на сегодняшний день — использование специальных вирусов.

Рисунок 4. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) человека, маркированные лентивирусом с зеленым флуоресцентным белком GFP.

собственные данные автора статьи, [4]

Современная генная инженерия достигла таких невиданных высот, что специалисты научились конструировать вирусы с заранее известными, тщательно отобранными для целей исследователей свойствами. Например, можно создать вирус, который способен заражать клетку — проникать через ее оболочку в ядро, — встраиваться в ДНК зараженной клетки, и больше ничего не делать: не создавать новые вирусные частицы, не копировать себя в геноме зараженной клетки, не экспрессировать ни один из вирусных генов. Вместо этого ученые смогли заставить вирус, который встроился в ДНК клетки, экспрессировать нужные белки (например, на этом принципе основана генотерапия). В частности, можно сделать так, что с ДНК вируса экспрессируется флуоресцентный белок [5], и зараженная клетка начинает светиться во флуоресцентном микроскопе (рис. 4).

Вирусы, которые способны направленно доставлять гены в ДНК клетки, стали называть вирусными векторами.

Как ВИЧ помогает ученым

На заметку: именно к этому семейству принадлежит вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). На его основе придуманы многие генетические векторы. Так что, в руках ученых ВИЧ из возбудителя страшной болезни превратился в послушный инструмент исследования.

Введение вектора в клетки для исследования их клонального состава принято называть маркированием клеток. Вы здесь совершенно справедливо спросите: «Позвольте, а где же здесь маркирование? Ну, ввели мы ДНК вируса в ДНК клетки, но дальше-то что?». А я Вам отвечу, что здесь-то и начинается самое интересное! Введенная ДНК действительно может выступать в роли маркера. Здесь есть два варианта: 1) маркером может служить не сама вирусная ДНК, а то место, куда она встроилась; 2) маркер может содержаться в самой вирусной ДНК.

Про то, каким удивительным образом в одном клеточном ядре величиной в несколько микрометров упаковываются молекулы ДНК, длина которых измеряется в метрах, читайте увлекательную статью на «Биомолекуле»: «Организовать геном: запутанная история гипотез и экспериментов» [6].

Рисунок 5. Модель фрактально-глобулярной структуры ДНК. Цветом здесь условно обозначены разные хромосомы.

Соответственно, у одного маленького вируса много возможностей, куда встроиться. В идеале — их бесконечно много, и поэтому найти две клетки, в которых бы вирусы встроились в абсолютно одинаковом месте, — довольно сложно. Еще один важный момент заключается в том, что если зараженная клетка решит поделиться, то обе ее дочерние клетки будут содержать провирус (так называется вирус, который встроился в геномную ДНК) в одном и том же месте генома! Другими словами, генетический маркер — наследуемый признак. Если научиться определять, в какое же именно место генома попал вирус в разных клетках, то можно было бы отличать потомство одной зараженной клетки от другой! И ученые умеют это! Существует несколько методов, позволяющих это сделать, главные из которых — метод саузерн-блоттинга и полимеразная цепная реакция, опосредованная лигированием [7], [8].

Про принцип гибридизации по Саузерну я отсылаю тебя, дорогой читатель, к другой замечательной статье, посвященной описанию важнейших методов молекулярной биологии: «Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии» [9]. А о полимеразной цепной реакции расскажет статья «12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция» [10].

Оба метода основаны на том, что вследствие случайного характера интеграции вируса в геномную ДНК расстояние от провируса до ближайшего сайта рестрикции будет разным в двух независимо зараженных клетках. Соответственно, если из зараженных клеток выделить ДНК и разрезать ее одной из рестриктаз, то длина фрагмента, содержащего провирус, будет разной у потомства двух разных зараженных клеток, и будет одинаковой у всех клеток, которые произошли в результате деления одной зараженной клетки. Если после рестрикции разделить фрагменты гель-электрофорезом [11], перенести на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовать с короткой последовательностью дезоксирибонуклотидов, комплементарной провирусу (такие олигонуклеотиды принято называть зондами), то на фотобумаге проявится набор полос, который будет одинаковым для клеточного потомства одной клетки и разным — для клеточного потомства нескольких зараженных клеток (рис. 6).

Рисунок 6. Саузерн-блот клеточных клонов, полученных из популяции, зараженной лентивирусным вектором. Каждая дорожка — результат саузерн-блоттинга ДНК из клеточного клона (клеточного потомства одной зараженной клетки). Набор полос в каждой дорожке соответствует продукту гибридизации зонда, комплементарного провирусу, с фрагментами расщепленной ДНК, содержащими провирус. Фрагменты разделены по длине с помощью гель-электрофореза.

собственные данные автора статьи, [4]

Из картинки видно, что на первых трех (и некоторых других дорожках — предлагаю читателю размяться и подсчитать их!) паттерн полос идентичен. Это говорит о том, что ДНК, проанализированная в этих образцах, получена из клеток, произошедших от одной исходно зараженной материнской клетки. Легко также заметить, что дорожка с таинственным названием Р5-4 содержит совершенно другой набор полос. Это означает, что ДНК, использованная здесь, принадлежала другой зараженной клетке. Недостаток такого метода в том, что он не позволяет в явном виде идентифицировать сайт интеграции провируса. Метод позволяет только сравнивать между собой клеточные клоны и судить об их родстве.

Другой метод, который позволяет анализировать сайты интеграции провирусов, — полимеразная цепная реакция, опосредованная лигированием [8]. Это достаточно сложный и многостадийный метод, который включает в себя рестрикцию ДНК, присоединение (лигирование) адаптеров, использование магнитных микрочастиц, ПЦР, электрофорез и секвенирование и заслуживает отдельной статьи. Прошу тебя, мой читатель, поверить мне на слово — этот метод позволяет с точностью до нуклеотида определить место в ДНК, в которое произошла интеграция провируса. С помощью этой методики можно не только различить потомство зараженных клеток между собой, но также судить о том, сколько вирусов проникло в ДНК зараженной клетки, в какие гены произошла интеграция, и не произошло ли изменение их экспрессии в результате внедрения вируса [12], [13].

Ранее я упомянул о том, что в качестве маркера, кроме места интеграции, можно использовать и саму ДНК провируса. Давайте рассмотрим подробнее, как это можно сделать. Здесь нам поможет химический синтез олигонуклеотидов! Дело в том, что в ДНК вируса можно вводить любую информацию: например, ген, кодирующий флуоресцирующий белок или фермент. Правда, тогда все вирусные частицы ничем не будут отличаться одна от другой и приобретут смысл маркеров только тогда, когда попадут в клетку. А почему бы не сделать сами вирусные частицы уникальными? Для этого ученые конструируют лентивирусные векторы, несущие так называемые генетические штрих-коды [14]. Суть заключается в том, что с помощью химического синтеза получают смесь олигонуклеотидов, где в некоторых позициях случайным образом содержится любой из четырех известных дезоксирибонуклеотидов. Дизайн штрих-кода может быть, например, таким:

ATC NNN GGA NNN TAT NNN CGA NNN ATT NNN GTG NNN

Здесь символы N обозначают любой из известных нуклеотидов (А, Т, C или G). Такой штрих-код ничего не кодирует, но он представляет собой смесь нуклеотидов с разными последовательностями. Приведенный штрих-код — на самом деле смесь из 4 18 (или приблизительно 10 11 после несложных, но утомительных математических преобразований) различных олигонуклеотидов! Такая смесь используется для сборки вирусов. На выходе получаются уже не обезличенные вирусы, похожие друг на друга как две капли воды, но целая библиотека вирусов, где каждая вирусная частица несет какой-то из возможных олигонуклеотидов-штрих-кодов. Клетки заражают такой вирусной библиотекой, и каждая зараженная клетка получает в свою ДНК уникальный стабильный наследуемый маркер в виде генетического штрих-кода. Все дочерние клетки будут нести тот же штрих-код (или набор штрих-кодов), который приобрела материнская клетка при заражении. Клеточное потомство двух разных зараженных материнских клеток будет иметь различные штрих-коды. Подобно тому, как штрих-коды на товарах в обычном продуктовом магазине позволяют однозначно идентифицировать и отличить один товар от другого, так генетические штрих-коды позволяют отличить потомство одной зараженной клетки от другой. Если затем из зараженной популяции клеток выделить ДНК и определить все присутствующие в ней штрих-коды с помощью новых методов секвенирования, то можно однозначно установить клональный состав клеточной популяции, проследить за динамикой клонов и выявить те клоны, которые преобладают над другими. После заражения библиотекой лентивирусов со штрих-кодами клеточная популяция становится как будто раскрашенной маркерами с очень-очень-очень разнообразной палитрой [15], примерно вот так (рис. 7):

Рисунок 7. Как выглядела бы клеточная популяция, если бы каждый генетический штрих-код имел свой цвет.

Рисунок 8. Канцелярские принадлежности.

Источник