Изоэлектрическая точка аминокислот
Мы рассмотрели превращение в кислой и щелочной средах моноаминомонокарбоновых кислот, в радикалах которых не содержится ионогенных групп (аминокислоты с недиссоциирующими радикалами).
Изменение суммарного заряда аминокислот с анионными и катионными группами в радикале, в зависимости от рН среды, можно представить в следующей таблице. Для сравнения в эту же таблицу поместим аминокислоты, в радикале которых нет диссоциирующих групп.
| Среда | ||
| Сильнокислая | Нейтральная | Сильнощелочная |
I. Аминокислоты с недиссоциирующими радикалами  | ||
| Заряд: +1 | -1 | |
II. Аминокислоты, содержащие в радикале анионные группы  | ||
| Заряд: +1 | -1 | -2 |
III. Аминокислоты, содержащие в радикале катионные группы  | ||
| Заряд: +2 | +1 | -1 |
Концентрация ионов водорода (pH), при которой аминокислота не перемещается в электрическом поле, называется изоэлектрической точкой данной аминокислоты (рI).
При pH ≠ pI в растворе присутствует равновесная смесь диполярного иона и катионной или анионной формы, что в некоторых случаях может привести к появлению у растворов аминокислот буферных свойств (подробнее см. учебное пособие «Общая химия, часть III» под редакцией профессора А.С. Берлянда, глава «Буферные системы»). Значительной буферной ёмкостью в интервале физиологических значений рН, (т.е. в интервале 6-8) обладает только гистидин. Отметим лишь, что при pH = pI растворы аминокислот буферного действия не проявляют.
При пропускании постоянного тока через раствор, содержащий смесь нескольких аминокислот, каждая из них будет двигаться к катоду или к аноду со скоростью, зависящей от природы этой аминокислоты и от рН среды. Разделение и анализ смесей амино-кислот, основанное на этом явлении, называется электрофорезом.
Кислотно-основные свойства аминокислот. Изоэлектрическая точка
Кислотно-основные свойства аминокислот связаны с наличием в их структуре двух ионизируемых групп-карбоксильной и аминогруппы, поэтому аминокислоты могут проявлять свойства как кислот, так и оснований, т.е. они являются амфотерными соединениями. В кристаллическом состоянии и в водных растворах a-аминокислоты существуют в виде биполярных ионов, называемых также цвиттерионами:
Ионное строение обуславливает некоторые особенности свойств a-аминокислот: высокую температуру плавления (200-300°С), нелетучесть, растворимость в воде и нерастворимость в неполярных органических растворителях. С растворимостью аминокислот в воде связана их всасываемость и транспорт в организме.
Ионизация молекул аминокислот зависит от рН раствора. В кислой среде аминокислоты заряжаются положительно и проявляют основные свойства:
В щелочной среде аминокислоты заряжаются отрицательно и проявляют кислотные свойства:
Для моноаминомонокарбоновых кислот процесс диссоциации имеет следующий вид:
Величины рК для аминокислот определяют по кривым титрования. Рассмотрим кривую титрования аланина.
Рис. 1 – кривые, полученные при титровании 0,1М раствора аланина 0,1М раствором HCl (а) и 0,1М растором NaOH (б)
Из кривой титрования аланина следует, что карбоксильная группа имеет рКa1=2,34, а протонированная аминогруппа рКa2 = 9,69. При рН = 6,02 аланин существует в виде биполярного иона, когда суммарный электрический заряд частицы равен 0. При этом значении рН молекула аланина электронейтральна. Такое значение рН при котором аминокислота находится в электронейтральном состоянии называют изоэлектрической точкой и обозначаются рI. Для моноаминомонокарбоновых кислот изоэлектрическая точка рассчитывается как среднее арифметическое двух значений рКa. Например для аланина она равна:
рI = ½ × (рКa1 + рКa2) = ½ × (2,34 + 9,69) = 6,02
При значении рН, превышающем изоэлектрическую точку, аминокислота заряжается отрицательно, а при значении рН ниже рI аминокислота несет суммарный положительный заряд. Например, при рН = 1,0 все молекулы аланина существуют в форме ионов с суммарным зарядом +1.
При рН = 2,34, когда имеется смесь равных количеств ионов
суммарный заряд = +0,5. Аналогичным образом можно предсказать знак и величину суммарного заряда для любой другой аминокислоты при любом значении рН.
Аминокислоты с ионизируемой группой в радикале имеют более сложные кривые титрования, складывающиеся из 3-ох участков, соответствующих трем возможным стадиям ионизации, и, следовательно, они имеют три значения рК (рКa1, рКa2 и рКR). Ионизация кислых аминокислот, например аспарагиновой, состоит из следующих последовательных стадий:
Изоэлектрические точки таких аминокислот определяются также присутствием ионизируемой группой радикала, наряду с a-амино и a-карбоксильными группами. Для моноаминодикарбоновых кислот изоэлектрические точки смещены в кислую область рН и определяются как среднее арифметическое между величинами рК для двух карбоксильных групп (рI аспарагиновой кислоты = 2,97). Для основных аминокислот рI смещены в щелочную область и вычисляются как среднее арифметическое между величинами рК для двух протонированных аминогрупп (рI лизина = 9,74).
Кислотно-основные свойства аминокислот используются для разделения и последующей идентификации аминокислот методами электрофореза и ионообменной хроматографии. Оба эти метода основаны на различиях в знаке и величине суммарного электрического заряда при данном значении рН.
Строение аминокислот. Изоэлектрическая точка. Характеристика пептидной связи
Даже и не знаю с чего начать, давайте попробуем вот так. Белки — это полимерные молекулы, которые состоят из молекул поменьше — мономеров. Этими мономерами будут аминокислоты. Поэтому, если нам хочется построить дом, то сначала нужно разобраться с кирпичами, правильно? Вот в этой статье и будем разбираться с аминокислотами: какие они бывают, сколько их и какие у них свойства. Дальше синтезируем пептид и определим — почему некоторые молекулы называются пептидами, а другие белками. Поймем почему про пептидную связь пишут, что она частично-двойная. А в конце небольшой подарок — торсионные углы. Вроде неплохо получилось? Тогда поехали.
Строение аминокислот
По названию все понятно, аминокислота — это молекула, которая содержит аминогруппу и карбоксильную группу. Но посмотрите на центральный углерод, что за бабник? У него целых четыре разных заместителя — водород, аминогруппа, карбоксильная группа и радикал. Он называется…. Альфа-углерод, такой альфа-самец прямо.
Такое общее строение у всех аминокислот, которые входят в состав белков, но они кое-чем отличаются. Да-да, радикалом. Основных аминокислот — 20 штук, хотя если честно, то 19. А если еще честнее, то их больше, но не будем путаться. У одной аминокислоты особенное строение, она даже не аминокислота вовсе, а иминокислота. Вот наша легенда — пролин.
Вернемся к различиям между аминокислотами. Есть несколько классификаций радикалов, но мы возьмем самую полезную для нас — по полярности. А если говорить простыми словами, то по растворимости радикала в воде. И тут все очень логично — радикалы делятся на неполярные и полярные. Первые нерастворимы в воде, а вторые растворимы. Когда будем говорить о строении белка, то поймем почему нас интересует только эта классификация.
Неполярные радикалы аминокислот
У этих ребят нет групп, которые могут образовать водородные связи с водой, поэтому они нерастворимы. Вместо этого у них есть алифатические и ароматические группы. Радикалы выделены фиолетовым цветом.
Опа, а глицин то получается не альфа-самец, у него два одинаковых заместителя — водороды.
Полярные радикалы аминокислот
Перед этим остановимся на одной вещичке. Я писал формулы аминокислот так, как будто они не находятся в растворе. Но если мы заглянем в клетку, pH в цитоплазме которой 7 и 0, то увидим такую картину.
Полярные радикалы можно разделить на две группы: полярные незаряженные и полярные заряженные.
В этих аминокислотах есть сильно электроотрицательные атомы — азот, кислород и сера. С их помощью молекулы образуют водородные связи и растворяются в воде. Но заряда у них нет.
Заряд у радикала может быть положительным или отрицательным, поэтому здесь небольшое деление.
Кстати, лучше растворимы в воде заряженные радикалы. Но разница между полярными заряженными и незаряженными не слишком большая. И еще одно — аспартат и глутамат это название аспарагиновой и глутаминовой кислот в растворе.
Аминокислоты делятся на полярные и неполярные. Полярные аминокислоты могут быть заряженными или незаряженными.
Аминокислоты называли по месту их выделения или физическим свойствам, поэтому у них такие странные названия. Гликос с греческого — сладкий, вот и глицин сладковат. Так что придется зазубрить это.
Изоэлектрическая точка
Вы уже заметили, что у аминокислот есть положительная и отрицательная части. Не так много молекул имеют такую особенность. Так что аминокислоты — это такой гибрид, поэтому их так и назвали — гибридные ионы. Правда на немецком…. А звучит это так: «Цвиттер-ион». Но как всегда есть один нюанс — у гибридного иона общий заряд молекулы равен нулю.
И вы уже смекнули, что не у всех аминокислот будет общий заряд равен нулю. Для неполярных и полярных незаряженных аминокислот это верно, но че делать с заряженными? До этого мы разбирали заряд аминокислот в клетке, то есть при нейтральном pH. Но что будет с ними, если поместить их в другие значения среды, например, в сильнощелочную или кислотную? Аминокислоты будут менять свой заряд и сейчас посмотрим как.
Думаю, что нужно кое-что уточнить. Вы понимаете, что эти реакции обратимы. Когда я добавляю кислоту или щелочь, неважно, то я смещаю реакцию в какую-то сторону. Пусть я добавляю кислоту. С каждой каплей реакция смещается в сторону образования глицина +1, но только при pH равном 2,34 в растворе будет большая часть глицина +1. Хотя на pH +3 большая часть будет глицина с зарядом 0. Надеюсь, что понятно объяснил.
Как же назвать pH при котором происходит переход из одной формы в другую? Очень просто, показатель константы диссоциации или pKa. Химики не корите, не слишком точно конечно, но запомнить легче. Получается, что в молекуле глицина pKa карбоксильной группы=2,34, а pKa аминогруппы=9,6. Я написал про молекулу глицина, потому что в остальных аминокислотах значения немного отличаются.
А теперь о том, ради чего все это затевалось — изоэлектрическая точка.
Изоэлектрическая точка — это pH среды, при которой заряд молекулы равен нулю. Да, вот так вот просто. Ее, кстати, можно посчитать — для этого нужно сложить pKa двух ближних функциональных групп и поделить на их количество. А их количество — две.
Сделаем тоже самое с молекулами посложнее, начнем с гистидина.
У гистидина есть заряженная группа, поэтому у него побольше вариантов заряда, чем у глицина. Мы видим, что у гистидина карбоксильная группа присоединяет водород при pH =1,82, а аминогруппа отдает протон водорода при pH=9,17. Вот про эти отличия я и говорил до этого, но так-то они не слишком большие. Радикал же отдает протон водорода при pH=6.
Сделаем тоже самое с глутаматом.
Думаю, что смысл понятен. У каждой аминокислоты своя собственная изоэлектрическая точка. Точки уже давно подсчитаны — достаточно найти их в интернете.
Сделаем красивый вывод:
Любая аминокислота цвиттер-ион, но только в изоэлектрической точке
Зачем это нужно? Ну давайте посмотрим. Мы знаем, что каждая аминокислота несет определенный заряд, но этот заряд меняется от pH среды. Если мы поместим аминокислоты в нейтральную среду и закинем туда катод и анод, то положительно заряженные аминокислоты направятся к аноду, а отрицательные к катоду. Остальные аминокислоты можно будет разделить с помощью изменения pH среды, ведь в изоэлектрической точке у аминокислоты не будет заряда. Нет заряда — нет движения к катоду или аноду, аминокислота стоит на месте. Вот мы и разделили аминокислоты в растворе, можно их изучить.
Образование пептидов
Теперь давайте соединим между собой парочку аминокислот, пусть это будет глицин и аланин. Соединяем их с помощью реакции дегидратации — отщепляем молекулу воды и получаем пептид.
Какие группы вступали в реакцию? Да, аминогруппа и карбоксильная группа. Получается, что пептидная связь — это связь между аминогруппой одной аминокислоты с карбоксильной группой другой аминокислоты. Так как соединены две аминокислоты, то название молекулы — дипептид. Ничего не мешает мне присоединить еще одну.
И это уже трипептид. Если соединены до 10 пептидов, то это олигопептид. От 10 до 50 — полипептид, ну а если больше 50, то это белок. Как видите реакция обратима, можно провести гидратацию по пептидной связи и пептид разрушится. На самом деле реакция гидратации идет намного лучше, а вот для дегидратации нужен источник энергии — АТФ, и рибосомальная РНК. Так что для синтеза пептидов/белков организм неплохо так тратится.
Ну и вы заметили, что я располагаю радикалы с разных сторон — то сверху, а то снизу. Это транс положение, оно более устойчиво, но можете писать как хотите.
Белок — это пептид, который содержит более 50 остатков аминокислот
Пептидная связь
У пептидной связи есть свои секретики, но мы не дадим ей хранить их просто так. Главный секрет в том, что двойная связь находится не у кислорода, а у азота… Хотя это не совсем двойная связь, но близка к ней. Как же это происходит? У азота есть неподеленная электронная пара, электроны могут перейти от азота к кислороду, а двойная связь перейдет от кислорода к азоту — неплохой такой обменчик. Это явление называется резонанс пептидной связи, именно из-за него во всех учебниках пишут про «частично-двойной характер пептидной связи».
Так как все углы по 120 градусов, то все 6 атомов — 3 углерода, азот, водород и кислород, лежат в одной плоскости, как будто на ладошке. За счет того, что углерод и азот образуют две связи — одну пи и одну сигму, вращение вокруг этих связей практически невозможно. Но об этом чуть позже, сейчас давайте упростим эту схему.
Это мы сделали только с одной пептидной связью, но что если добавить вторую? Получится кое что интересненькое…
Следующая пептидная связь такая же, как и предыдущая. Получается, что опять 6 атомов лежат в одной плоскости, вы видите, что один атом углерода принадлежит сразу к двум плоскостям и это удивительно! Можно даже подумать, что все эти пептидные связи будут лежать в одной и той же плоскости, но это не так, а виной этому — вращение вокруг связей.
Диэдральные или торсионные углы
Название пугающее, но сейчас как устроим этим углам! Так, мы уже говорили о том, что вокруг пептидной связи не повращаться из-за того, что она частично двойная. Но ведь есть и другие связи, вокруг которых можно устроить веселуху.
Понимаю, что представить это не так уж и легко, но можно попробовать сделать! Получится конечно не совсем так, но принцип поймем. Возьмем ручку и два колпачка, засунем бумажку под каждый колпачок и начнем крутить. Условимся, что мои пальцы — альфа-углеродный атом, то есть место пересечения двух плоскостей.
Теперь мы поняли, как происходит вращение, но это еще не все. Существуют определенные углы между плоскостями и всего их два. Представьте, что нам захочется найти угол между углеродами, у которых карбоксильная группа, двух плоскостей. Или угол между двумя атомами азота, опять же, двух разных плоскостей. Задачка кажется сложной… Но перед этим, а зачем я вообще мучаю вас этим? Дело в том, что когда мы дойдем до конформации белковых молекул, то благодаря этим углам мы поймем: как и почему образуется альфа-спираль, тоже самое с бета-складчатостью. Так что потерпите немного!
Если посмотреть на эту схему, то можно кое-что прикинуть: если мы будем вращать связь между N и C, то углерод с карбоксильной группой изменит положение относительно углерода другой плоскости, а вот азот останется на том же месте — угол между двумя азотами не изменится. А вот если начнем вращать связь между C и C, то все будет наоборот: угол между азотами изменится, но вот углероды с карбоксильной группой останутся на месте. Сложновато, но чуть дальше я дам пространственную картинку. Пока что мы пришли к выводу, что связь между N и C влияет на угол между углеродами — этот угол называется фи. А вот связь между C и C влияет на угол между атомами азота — угол пси.
Теперь можно и добавить атомы водорода в схему, они скоро нам понадобятся.
Торсионные углы в пептидах. Первая картинка с https://proteopedia.org/wiki/index.php/Tutorial:Ramachandran_principle_and_phi_psi_angles
А теперь главный вопрос — как измерить эти углы? Хорошо, что уже это придумали… И мы можем сделать это вместе — заходите сюда и поехали! Первым делом нам нужно перевернуть молекулу так, чтобы расположить атом углерода с карбоксильной группой сверху. Зачем такие выкрутасы? Расскажу позже. А теперь посмотрим прямо в альфа атом углерода, да так что за ним спрятался азот. Как-то это странно звучит, но давайте попробуем.
Еще это можно посмотреть графически с помощью проекций Ньюмана.
Так, повторим что такое угол фи — это угол между двумя карбоксильными атомами углерода. На рисунке уже их видно.
Поняли зачем так крутили молекулу? Да, просто так нам удобнее смотреть угол. А теперь начнем вращать и посмотрим как меняются углы.
Угол пси по такой же логике. Крутим молекулу, чтобы атом азота оказался сверху и смотрим прямо в альфа атом углерода.
Еще разок построим проекцию Ньюмана, она немного отличается, и сразу же отметим углы.
Думаю, что принцип понятен. Дальше можете покрутить сами, правильно? Я не сказал про одно большое «НО» — не каждый угол возможен, так как у атомов есть электронные оболочки, которые заряжены отрицательно. Если электронные оболочки подходят слишком близко, то они отталкиваются и угол меняется. Какие углы возможны? Для этого еще разок зайдите сюда и включите на панельке справа силы Ван-дер-Вальса и show clashes.
Подробнее о влиянии этих углов в следующей статье.
Хочешь задать вопрос, похвалить или наговорить гадостей? Тогда залетай в телегу. Там ты сможешь предложить новый формат или разбор темы. А если серьёзно, то эти статьи пишутся для вас, поэтому мне важна обратная связь.
Как посчитать изоэлектрическую точку аминокислоты
!) Аммонолиз галогензамещенных кислот.
2) Метод Штеккера- Зелинского
Включает стадии образования аминонитрила при взаимодействии альдегида с HCN и NH3 c последующим гидролизом его в аминокислоту. В качестве реагента применяют смесь NaCN и NH4Cl.
3) Алкилирование N-фталимидмалонового эфира
5) Из оксимов циклических кетонов перегруппировкой Бекмана.
Аминокислоты дают реакции, характерные для карбоксильной и аминогрупп, и, кроме того, проявляют специфические свойства, которые определяются наличием двух функциональных групп и их взаимным расположением.
2.1. Кислотно-основные свойства
Ионное строение аминокислот подтверждается их физическими свойствами. Аминокислоты – нелетучие кристаллические вещества с высокими температурами плавления. Они нерастворимы в неполярных органических растворителях и растворимы в воде. Их молекулы обладают большими дипольными моментами.
Форма существования аминокислот в водных растворах зависит от рН. В кислых растворах аминокислоты присоединяют протон и существуют преимущественно в виде катионов. В щелочной среде биполярный ион отдает протон и превращается в анион.
При некотором значении рН, строго определенном для каждой аминокислоты, она существует преимущественно в виде биполярного иона. Это значение рН называют изоэлектрической точкой (рI). В изоэлектрической точке аминокислота не имеет заряда и обладает наименьшей растворимостью в воде. Катионная форма аминокислоты содержит два кислотных центра (COOH и NH3 + ) и характеризуется двумя константами диссоциации рКа1 и рКа2. Значение рI определяется по уравнению:
2.2. Реакции по аминогруппе
Аминокислоты содержат первичную аминогруппу и подобно первичным аминам взаимодействуют с азотистой кислотой с выделением азота. При этом происходит замещение аминогруппы на гидроксильную.
Реакция используется для количественного определения аминокислот по объему выделившегося азота (метод Ван-Слайка).
Алкилирование и арилирование
При взаимодействии аминокислот с избытком алкилгалогенида происходит исчерпывающее алкилирование аминогруппы и образуются внутренние соли.
Аминокислоты арилируются 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ) в щелочной среде. Реакция протекает как нуклеофильное замещение в активированном ароматическом кольце.
Реакция используется для установления аминокислотной последовательности в пептидах.
Аминокислоты взаимодействуют с ангидридами и хлорангидридами с образованием N-ацильных производных.
Реакция используется для защиты аминогруппы в синтезе пептидов. Такая защита должна легко сниматься, а амиды, как известно, гидролизуются в жестких условиях. При разработке методов синтеза пептидов были найдены защитные группы, которые легко удаляются путем гидролиза или гидрогенолиза.
трет-Бутоксикарбонильная защита (БОК-защита).
Легкость снятия защиты обусловлена устойчивостью бензил- и трет-бутил-катионов, которые образуются в качестве интермедиатов.
2.3. Реакции по карбоксильной группе
При сухой перегонке в присутствии гидроксида бария аминокислоты декарбоксилируются с образованием аминов.
Аминокислоты взаимодействуют со спиртами в присутствии газообразного HCl как катализатора с образованием сложных эфиров.
В отличие от самих аминокислот, их сложные эфиры – легко летучие соединения и могут быть разделены путем перегонки или газожидкостной хроматографии, что используется для анализа и разделения смесей аминокислот, полученных при гидролизе белков.
Получение галогенангидридов и ангидридов
При действии на защищенные по аминогруппе аминокислоты галогенидов фосфора или серы образуются хлорангидриды.
Реакция используется для активации карбоксильной группы при нуклеофильном замещении. Чаще для этой цели получают смешанные ангидриды, которые являются более селективными ацилирующими реагентами.
Реакция используется для активации аминогруппы в синтезе пептидов.
2.4. Специфические реакции аминокислот
Реакции с одновременным участием карбоксильной и аминогрупп идут, как правило, с образованием продуктов, содержащих термодинамически устойчивые 5-ти- и 6-тичленные гетероциклы.
Отношение аминокислот к нагреванию
Превращения аминокислот при нагревании зависят от взаимного расположения карбоксильной и аминогруппы и определяются возможностью образования термодинамически стабильных 5-ти- 6-тичленных циклов
Реакция используется для количественного анализа аминокислот методом фотометрии.
3.1. Строение и классификация
Природные аминокислоты отвечают общей формуле RCH(NH2)COOH и отличаются строением радикала R. Формулы и тривиальные названия важнейших аминокислот приведены в таблице. Для биологического функционирования аминокислот в составе белков определяющим является полярность радикала R. По этому признаку аминокислоты разделяют на следующие основные группы (см. таблицу).
Аминокислоты, содержащие неполярный радикал R
Аминокислоты, содержащие полярный неионогенный радикал R
Аминокислоты, содержащие полярный положительно заряженный радикал R
Аминокислоты, содержащие полярный отрицательно заряженный радикал R
Аминокислоты, содержащие неполярный радикал R. Такие группы располагаются внутри молекулы белка и обуславливают гидрофобные взаимодействия.
Аминокислоты, содержащие полярный неионогенный радикал R. Аминокислоты этого типа имеют в составе бокового радикала полярные группы, не способные к ионизации в водной среде (спиртовый гидроксил, амидная группа). Такие группы могут располагаться как внутри, так и на поверхности молекулы белка. Они участвуют в образовании водородных связей с другими полярными группами.
Аминокислоты, содержащие радикал R, способный к ионизации в водной среде с образованием положительно или отрицательно заряженных групп. Такие аминокислоты содержат в боковом радикале дополнительный основный или кислотный центр, который в водном растворе может соответственно присоединять или отдавать протон.
В белках ионогенные группы этих аминокислот располагаются, как правило, на поверхности молекулы и обуславливают электростатические взаимодействия.
Природные аминокислоты относятся к L-ряду.
Большинство аминокислот содержат один хиральный центр и имеют два стереоизомера. Аминокислоты изолейцин, треонин, гидроксипролин, 5-гидроксилизин и цистин содержат два хиральных центра и имеют (кроме цистина) 4 стереоизомера, из которых только один встречается в составе белков.
Так, из 4-х стереоизомеров треонина в природе встречается только (2S,3R)-2-амино-3-гидроксибутановая кислота.
Использование для построения белков только одного вида стереоизомеров имеет важное значение для формирования их пространственной структуры и обеспечения биологической активности.
Сначала рацемическую аминокислоту ацилируют уксусным ангидридом:
Затем рацемическую смесь ацетильных производных подвергают ферментативной обработке. При этом гидролизуется ацетильное производное только L-аминокислоты:
Полученная после ферментативного смесь легко разделяется, так как свободная L-аминокислота растворяется и в кислотах, и в щелочах, а ацилированная – только в щелочах.
3.3. Кислотно-основные свойства.
По кислотно-основным свойствам аминокислоты разделяют на три группы.
Нейтральные аминокислоты не содержат в радикале R дополнительных кислотных или основных центров, способных к ионизации в водной среде. В кислой среде они существуют в виде однозарядного катиона и являются двухосновными кислотами по Бренстеду. Как видно на примере аланина, изоэлектрическая точка у нейтральных аминокислот не равна 7, а лежит в интервале 5,5 – 6,3.
Основные аминокислоты содержат в радикале R дополнительный основный центр. К ним относятся лизин, гистидин и аргинин. В кислой среде они существуют в виде дикатиона и являются трехосновными кислотами. Изоэлектрическая точка основных аминокислот, как видно на примере лизина, лежит в области рН выше 7.
Кислые аминокислоты содержат в радикале R дополнительный кислотный центр. К ним относятся аспаргиновая и глутаминовая кислоты. В кислой среде они существуют в виде катиона и являются трехосновными кислотами. Изоэлектрическая точка этих аминокислот лежит в области рН много ниже 7.
Тирозин и цистеин содержат в боковых радикалах слабые кислотные центры, способные к ионизации при высоких значениях рН.
Важное значение имеет тот факт, что при физиологическом значении рН (
7) ни одна аминокислота не находится в изоэлектрической точке. В организме все аминокислоты ионизированы, что обеспечивает им хорошую растворимость в воде.
Различие в кислотно-основных свойствах используется для разделения аминокислот методом электрофореза и ионообменной хроматографии. При данном значении рН разные аминокислоты могут иметь разный по величине и знаку электрический заряд. Например, при рН6 лизин имеет заряд +1 и движется к катоду, аспаргиновая кислота имеет заряд –1 и перемещается к аноду, а аланин находится в изоэлектрической точке и не перемещается в электрическом поле. Таким образом при рН6 они могут быть разделены с помощью электрофореза.
Для разделения аминокислот методом ионообменной хроматографии используют катионообменные смолы (сульфированный полистирол). Процесс ведут в кислой среде, когда аминокислоты находятся катионной форме.
Скорость продвижения аминокислот по хроматографической колонке зависит от силы их электростатических и гидрофобных взаимодействий со смолой. Наиболее прочно связываются со смолой основные аминокислоты, имеющие наибольший положительный заряд, наименее прочно – кислые аминокислоты. Наибольшим гидрофобным связыванием со смолой обладают аминокислоты с неполярными боковыми радикалами, особенно ароматическими. Таким образом, порядок элюирования аминокислот следующий. Легче других элюируются кислые аминокислоты (Asp и Glu), следом за ними идут аминокислоты, содержащие полярные неионогенные группы (Ser, Thr, Asn, Gln), затем из колонки вымываются аминокислоты с неполярными боковыми радикалами (Phe, Trp, Ile и др.) и в последнюю очередь элюируются основные аминокислоты (His, Lys, Arg).
Формально пептиды можно рассматривать как продукты поликонденсации аминокислот.
Аминокислотные остатки в пептиде связаны амидными (пептидными) связями. Один конец цепи, на котором находится аминокислота со свободной аминогруппой, называют N-концом. Другой конец, на котором находится аминокислота со свободной карбоксильной группой, называют С-концом. Пептиды принято записывать и называть, начиная с N-конца.
Название пептида строят на основе тривиальных названий, входящих в его состав аминокислотных остатков, которые перечисляют, начиная с N-конца. При этом в названиях всех аминокислот за исключением С-концевой суффикс “ин” заменяют на суффикс “ил”. Для сокращенного обозначения пептидов используют трехбуквенные обозначения входящих в его состав аминокислот.
Пептид характеризуется аминокислотным составом и аминокислотной последовательностью.
Аминокислотный состав пептида может быть установлен путем полного гидролиза пептида (расщепления до аминокислот) с последующим качественным и количественным анализом образовавшихся аминокислот методом ионобменной хроматографии или ГЖХ-анализом сложных эфиров аминокислот. Полный гидролиз пептидов проводят в кислой среде при кипячении их с 6н. HCl.
Одному и тому же аминокислотному составу отвечает несколько пептидов. Так, из 2-х разных аминокислот может быть построено 2 дипептида, из трех разных аминокислот – 6 трипептидов, из n разных аминокислот n! пептидов одинакового состава. Например, составу Gly:Ala:Val=1:1:1 отвечают следующие 6 трипептидов.
Gly-Ala-Val Gly- Val-Ala Val-Gly-Ala Val-Ala-Gly Ala-Gly-Val Ala-Val-Glu
Таким образом, для полной характеристики пептида необходимо знать его аминокислотный состав и аминокислотную последовательность.
4.2. Определение аминокислотной последовательности
Для определения аминокислотной последовательности используют комбинацию двух методов: определение концевых аминокислот и частичный гидролиз.
Определение N-концевых аминокислот.
Метод Сегнера. Пептид обрабатывают 2,4-динитрофтробензолом (ДНФБ), а затем полностью гидролизуют. Из гидролизата выделяют и идентифицируют ДНФ-производное N-концевой аминокислоты.
Метод Эдмана состоит во взаимодействии N-концевой аминокислоты с фенилизотиоцианатом в щелочной среде. При дальнейшей обработке слабой кислотой без нагревания происходит отщепление от цепи “меченой” концевой аминокислоты в виде фенилгидантоинового (ФТГ) производного.
Преимущество этого метода состоит в том, что при отщеплении N-концевой аминокислоты пептид не разрушается и операцию по отщеплению можно повторять. Метод Эдмана используют в автоматическом приборе – секвенаторе, с помощью которого можно осуществить 40 – 50 стадий отщепления, идентифицируя полученные на каждой стадии ФТГ-производные методом газожидкостной хроматографии.
Частичный гидролиз полипептидов
При частичном гидролизе пептиды расщепляются с образованием более коротких цепей. Частичный гидролиз проводят с помощью ферментов, которые гидролизуют пептидные связи избирательно, например, только с N-конца (аминопептидазы) или только с С-конца (карбоксипептидазы). Существуют ферменты, расщепляющие пептидные связи только между определенными аминокислотами. Меняя условия гидролиза, можно разбить пептид на различные фрагменты, которые перекрываются по составляющим их аминокислотным остаткам. Анализ продуктов частичного гидролиза позволяет воссоздать структуру исходного пептида. Рассмотрим простейший пример установления структуры трипептида. Частичный гидролиз по двум разным направлениям трипептида неизвестного строения дает продукты представленные на схеме.
Единственный трипептид, структура которого не противоречит продуктам частичного гидролиза – Gly-Ala-Phe.
Установление аминокислотной последовательности пептидов, содержащих несколько десятков аминокислотных остатков, – более сложная задача, которая требует комбинации различных методов.
Синтез пептида с заданной аминокислотной последовательностью – чрезвычайно сложная задача. В простейшем случае синтеза дипептида из 2-х разных аминокислот возможно образование 4-х разных продуктов.
В настоящее время разработана стратегия синтеза пептидов, основанная на использовании методов активации и защиты функциональных групп на соответствующих этапах синтеза. Процесс синтеза дипептида включает следующие стадии:
Таким образом, последовательно присоединяя аминокислоты, шаг за шагом наращивают цепь полипептида. Такой синтез очень длителен, трудоемок и дает низкий выход конечного продукта. Основные потери связаны с необходимостью выделения и очистки продуктов на каждой стадии.
Этих недостатков лишен используемый в настоящее время твердофазный синтез пептидов. На первой стадии защищенная по аминогруппе С-концевая аминокислота закрепляется на твердом полимерном носителе (полистироле, модифицированном введением групп –CH2Cl). После снятия защиты проводят ацилирование аминогруппы закрепленной на носителе аминокислоты другой аминокислотой, которая содержит активированную карбоксильную и защищенную аминогруппу. После снятия защиты проводят следующую стадию ацилирования. Отмывание продукта от примесей проводят прямо на носителе и лишь после окончания синтеза полипептид снимают с носителя действием бромистоводородной кислоты. Твердофазный синтез автоматизирован и проводится с помощью приборов – автоматических синтезаторов.
Методом твердофазного синтеза получено большое количество пептидов, содержащих 50 и более аминокислотных остатков, в том числе инсулин (51 аминокислотный остаток) и рибонуклеаза (124 аминокислотных остатка).